研發(fā)服務(wù)
熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應(yīng)進(jìn)行實時的監(jiān)測，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內(nèi)參照，對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行半定量檢測。
熒光定量PCR技術(shù)具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運用該項技術(shù)，可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、絕對定量和定性分析。
菲優(yōu)特檢測生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、絕對定量和定性分析。
SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無需設(shè)計探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，實驗周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。
TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗豐富的實驗技術(shù)人員設(shè)計探針，對目標(biāo)基因有高特異性，實驗重復(fù)性好，相對于SYBR Green法，靈敏度更高。
熒光定量PCR檢測分類
1、mRNA表達(dá)量水平檢測：相對定量法。
2、MicroRNA表達(dá)量水平檢測：通過設(shè)計特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，結(jié)合實時定量PCR可以精確檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平。內(nèi)參基因一般用U6。
3、基因拷貝數(shù)檢測：如檢測樣品中不同細(xì)菌含量、基因工程菌目的基因拷貝數(shù)、環(huán)境中耐藥基因檢測等。采用絕對定量法。
熒光定量PCR服務(wù)內(nèi)容
1、絕對定量：
絕對定量首先必須構(gòu)建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作3個點以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的檢測樣品進(jìn)行絕對量(起始拷貝數(shù))分析。
2、相對定量(mRNA表達(dá)量分析)：
基因表達(dá)的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標(biāo)同時分別進(jìn)行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進(jìn)行比較，可以對不同樣品間的mRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。參比基因通常選用表達(dá)量相對恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過同時對參比基因的實時檢測，可以對樣品之間由于起始細(xì)胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進(jìn)行校正，達(dá)到在嚴(yán)格意義上對樣品之間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析之目的。
熒光定量PCR服務(wù)流程
總RNA提取及定量 → PCR引物設(shè)計及反轉(zhuǎn)錄 → 熒光引物設(shè)計(SYBR Green 熒光染料法)/探針設(shè)計(TaqMan 熒光探針法) → 熒光定量PCR，進(jìn)行擴增曲線、溶解曲線、表達(dá)量差異分析等實驗 → 數(shù)據(jù)分析與處理
熒光定量PCR送檢要求
新鮮或保存完好的樣品——細(xì)胞：≥１×１０６，組織≥２０ ?ｍｇ，血液≥２００μｌ。組織樣品用液氮速凍后保存于－８０℃，細(xì)胞也可以在加入Ｔｒｉｚｏｌ后保存于－８０℃，后續(xù)樣品需用干冰寄送。樣品需要注意避免各類污染和反復(fù)凍融。
菲優(yōu)特檢測秉承“科學(xué) · 獨立 · 誠信 · 高效”的服務(wù)理念，以專業(yè)、專注的態(tài)度為您提供精確的檢測技術(shù)和咨詢、科研服務(wù)。
